精子冷冻保存的一般步骤
2015-08-11 16:14:53成都西区安琪儿妇产医院
冷冻方法保存活细胞的基本原理依赖于对分子运动的控制。生命过程要求有生化变化，这是通过分子在水基质中的运动来实现的，假如一个活细胞原生质中及其周围的水分，足以被捕获分子运动的低温转换成冰，而且如果这种生物系统能在今后解冻而不受损，那么处于这种“假死”状态的细胞的生命就能被保存下来。
（一）精子的收集
禁欲期（通常为3～5d）后，用手淫方法将精子收集于10～20mL无菌的聚丙烯样品收集容器中。要求禁欲期是为了更好地冷冻保存样品。通常而言，这样的精子与收集前禁欲期较短及不规则的精子相比，冷冻保存后的特性更恒定且更完善。
射出的精液是液态的，但正常情况下立即凝结成胶状。凝结后的精液通常在30min内液化，此时就可测定其体积。为了使精子获得*的冷冻存活力，应在收集精液后1min内开始对液化精子进行冷冻保存处理。
（二）体积的测量
体积可用较准的加样器或带针头的5mL注射器来测量，有时也可根据收集精液前后采样瓶的重量之差来计算。取0.1～0.2mL精液作精液分析（活动精子的百分数及其质量、精子密度等，参见本书有关章节），此外尚需取出一些精液，同时以用来做筛选某种性传染疾病的检测、进行某些检测以筛选导致性病的微生物如奈瑟淋球菌等。
（三）甘油化
甘油作为冷冻保护剂，可以分步方式直接加入到未经处理的精液之中。每次加入后混匀，时间间隔为1min；或间接地作为扩张液或基液的组分，经稀释后逐步加入精液。而在美国与加拿大，40%以上的*精子库，仍单独使用甘油作为冷冻保护剂，而越来越多的新的精子库则使用扩张剂，尤其是含甘油的两性离子缓冲系统。
甘油化的条件不一定涉及温度的特殊条件（除了室温之外）和接触时间（除了加入甘油及混匀所需时间之外）。
（四）包装和存活力观察
甘油化的精液可吸入塑料吸管（可用封口剂，加热，或用尼龙塞来密封）或放入玻璃安瓿（用火焰封口），也可放入塑料冷冻管（冷冻小瓶）后用螺口盖拧紧。每份冷冻精液的体积通常是0.4～0.8mL，这可作为*的一个单位。当然如果合适，*也可能使用一个单位以上的精液，选择用于冷冻保存精子的容器是很重要的。这种容器应是易于标记、操作、储存，同样也应具有很好的生物兼容性以及抗压性能。高质量的聚丙烯吸管或小瓶看来*这些标准，而没有易碎及被洗涤剂污染等玻璃容器所具有的缺点。
放入液氮冷冻之前，除了要对被冷冻和储备的精子进行分装以外，还需准备一份质量控制检测样品。对收集后未经处理的精液、用冷冻保护剂处理过的精液以及储存前、冻融后的精液均应观察其中的活动精子及其活动力。通过观察能追踪冷冻保存各阶段的精子生存情况，并能确保了解冷冻精子的存活能力。
（五）冷冻
吸管、安瓿中的精液冷冻保存时可分散或成组贮存，其位置保持垂直、水平或倾斜。通常是放在液氮气雾中，有时也可放在机械（电子）冷冻柜的冷冻气中。冷却和冷冻过程则可用人工以静态或逐步方式，也可用电脑控制的液氮供给系统来完成。*常用的是操作者利用液氮储存容器中的气相以直接一次性或逐渐方式进行冷冻。带有吸附液氮的石棉衬垫的生物干燥运送器，也能在气相中用于冷冻，然后在液相中转移到储存容器。
（六）储存
经分装的样品，均应贮存在金属容器内的液氮之中，而这些容器则应放置在适当的液氮冷冻箱之内。用以监视液氮水平面的装置［机械的和（或）电子的］是为了长期储存在高于液氮温度（-196℃）的情况下防止丧失精子功能，监视水平面的常见机械（手工）方法是将一根带刻度的插杆垂直放入液氮底部后拔出，则在其上面就会形成一条霜线，以指示液氮水平面，至于各种复杂的局部和遥控电子警报系统现许多*均已有市售。另一方面，少数精子库只使用闪烁灯定期用肉眼检查，AATB的组织库标准只要求一个有效的监测程序，以确保样品始终储存在液氮表面之下。冷冻生物学家和有关研究人员，通过融解储存前样品，并进行检测，发现在冷冻刚开始期间精子活动力有某些丢失。然而以后储存在液氮表面之下-196℃的冷冻精子，活动力没有进一步丢失，人们已经证实癌症患者*前精液中的精子冷冻生存活动力往往是差的（解冻后精子活动力百分数降低），尽管如此，这降低了的运动能力在长期储存期间并不进一步降低。
在所调查的42家AATB成员的组织库中，只有2家报道了精液［由正常供精者及（或）*前患者提供］长期保存期间精子活动力丧失的例子。另有报道只有1例冷冻保存3年后精子活动力丧失。可以为人们所接受的观点是，贮存过程中精子活动力丧失系冷冻前没有准确测定所致或更可能是由于没有确保适宜储存条件所造成的。
（七）解冻
将装有冷冻精子的包装盒暴露于空气或水中即可使冷冻精液恢复液态。通常暴露在室温，但也可暴露在其他温度下，这要根据各精子库设计的方法学而定。
（八）分发
若临床医师需要冷冻精子以开展IVF-ET，精子库应按要求送到该医师所在医院（或）诊所。冷冻精子从精子库的贮存柜取出后应放在预先盛有液氮或固体二氧化碳（干冰）的特殊运送盒内。然而，精子库若就在医院内，且离操作室甚近，则可不必放在上述特殊运送盒内，而可直接送到操作室供医师使用。冷冻精子在送临床使用前的融化有助于通过质量控制，再次评估精子冷冻存活状态。
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